ABSTRACT Most anticancer drugs like doxorubicin (DXR) have low specificity that results in undesirable effects especially when it comes to collateral effects on reproduction. Plants are excellent sources when searching for new drugs. Auxemma oncocalyx (A. oncocalyx) and its main component Oncocalyxone A (onco A) have anti-tumoral activity and are less toxic than DXR in reproductive parameters. However, there are no studies on the action of these drugs regarding the porcine in vitro oocyte competence and embryo development. The aim of this study was to evaluate the effect of A. oncocalyx and onco A exposure during in vitro maturation (IVM) of oocytes (Experiment 1) or in vitro embryo culture (IVC) (Experiment 2) on the oocyte developmental competence. For experiment 1, COCs were distributed in IVM medium alone (control) or supplemented with DXR (0.3 (g/mL), A. oncocalyx (1.2 (g/mL) and onco A (1 (g/mL). Then, oocytes were submitted to in vitro fertilization (IVF) and in vitro embryo culture. For experiment 2, zygotes were cultured with DXR, A. oncocalyx and onco A for 7 days. Viability, maturation, fertilization and embryo developmental parameters were evaluated in both experiments. In experiment 1; DXR, A. oncocalyx and onco A reduced (P<0.05) oocyte viability and IVM efficiency. Onco A increased (P<0.05) the meiotic resumption. After IVF, all drugs reduced (P<0.05) viability, IVF efficiency and percentage of cleaved embryos, nevertheless, only DXR decreased the percentage of blastocyst. In experiment 2; all drugs reduced (P<0.05) the percentage of penetration, but only DXR and onco A decreased (P<0.05) IVF efficiency. DXR and A. oncocalyx decreased (P<0.05) the percentage of cleaved embryo, but had no effect on blastocyst formation. In conclusion, the addition of DXR during IVM or IVC negatively affected the IVF efficiency and cleavage rate. In addition, the exposure of COCs to DXR only during IVM was more detrimental to oocyte viability and blastocyst formation than A. oncocalyx and onco A.

RESUMEN La mayoría de los medicamentos contra el cáncer como la doxorrubicina (DXR) tienen una baja especificidad que produce efectos indeseables, especialmente cuando se trata de efectos colaterales en la reproducción. Las plantas son excelentes fuentes cuando se buscan nuevos medicamentos. Auxemma oncocalyx (A. oncocalyx) y su componente principal Oncocalyxone A (onco A) tienen actividad antitumoral y son menos tóxicos que DXR en los parámetros reproductivos. Sin embargo, no hay estudios sobre la acción de estos medicamentos con respecto a la competencia de los ovocitos in vitro porcina y el desarrollo embrionario. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la exposición a A. oncocalyx y onco A durante la maduración in vitro (IVM) de los ovocitos (Experimento 1) o el cultivo de embriones in vitro (IVC) (Experimento 2) en la competencia del desarrollo de los ovocitos. Para el experimento 1, los COC se distribuyeron en medio IVM solo (control) o suplementado con DXR (0.3 µg / mL), A. oncocalyx (1.2 µg / mL) y onco A (1 µg / mL). Luego, los ovocitos se sometieron a fertilización in vitro (FIV) y cultivo embrionario in vitro. Para el experimento 2, los cigotos se cultivaron con DXR, A. oncocalyx y onco A durante 7 días. Se evaluaron los parámetros de viabilidad, maduración, fertilización y desarrollo embrionario en ambos experimentos. En el experimento 1; DXR, A. oncocalyx y onco A redujeron la viabilidad de los ovocitos (P <0.05) y la eficiencia de IVM. Onco A aumentó (P <0.05) la reanudación meiótica. Después de la FIV, todos los medicamentos redujeron la viabilidad (P <0.05), la eficacia de la FIV y el porcentaje de embriones clivados, sin embargo, solo DXR disminuyó el porcentaje de blastocistos. En el experimento 2; todos los medicamentos redujeron (P <0.05) el porcentaje de penetración, pero solo DXR y onco A disminuyeron (P <0.05) la eficacia de la FIV. DXR y A. oncocalyx disminuyeron (P <0.05) el porcentaje de embriones clivados, pero no tuvieron efecto sobre la formación de blastocistos. En conclusión, la adición de DXR durante IVM o IVC afectó negativamente la eficiencia de IVF y la tasa de clivaje. Además, la exposición de los COCs a DXR solo durante la IVM fue más perjudicial para la viabilidad de los ovocitos y la formación de blastocistos que A. oncocalyx y onco A.

Resumo A criopreservação seminal apresenta baixos resultados produtivos. Objetivou-se testar a Água de Coco em Pó (ACP-103®) como diluente de ressuspensão após a descongelação seminal e avaliar a qualidade espermática durante a curva de resfriamento até a descongelação do sêmen. Para isso, o sêmen de 15 reprodutores foi coletado uma vez por semana, incubado a 30 ºC por 15 minutos, e em seguida diluído em Beltsville Thawing Solution - BTS (controle) ou em ACP-103®, e submetidos a uma curva de resfriamento lenta, onde foram feitas análises de vigor e motilidade em cada passo. O sêmen descongelado foi ressuspenso em seus respectivos diluentes e analisado quanto às características: vigor, motilidade, vitalidade, integridade acrossomal e funcionalidade da membrana. Durante as análises de vigor e motilidade que compõem a curva de resfriamento, e na descongelação, para as análises de vitalidade e membrana acrossomal intacta, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Já após a descongelação, o BTS apresentou melhores resultados de vigor, motilidade espermática e funcionalidade da membrana. No entanto, a curva de resfriamento e o ACP-103® podem ser utilizadas no protocolo de criopreservação do sêmen suíno, visto que ambas asseguraram qualidade da viabilidade espermática.

Abstract Semen cryopreservation is associated with low productivity results. This study aimed to test the Coconut Water Powder (ACP®-103) as a ressuspension diluent after thawing semen, also evaluate sperm quality during the cooling curve until thawing of the semen. For this, the semen was collected from 15 boars once a week, incubated at 30 ºC for 15 minutes, and afterwards, the samples were diluted in the diluent Beltsville Thawing Solution - BTS (Control) or ACP-103®, and subjected to a slow cooling curve, where the force and the motility were analyzed in each step. The thawed semen was ressuspended in its respective solvents and analyzed in the characteristics of vigor, motility, vitality, acrosome integrity and functionality of the membrane. During the analysis of vigor and motility that make up the cooling curve, and thawing, for analysis of vitality and intact acrosomal membrane, it was observed that there was no significant difference between treatments. Besides, after thawing, the BTS showed better results of sperm vigor, sperm motility and membrane functionality. However, the cooling curve and coconut water powder can be used in the protocol for cryopreservation of boar semen, as both ensured quality of sperm viability that may be used in artificial insemination.

RESUMO: Objetivou-se avaliar o efeito da adição dos antioxidantes ácido ascórbico, melatonina e Trolox C, associados ao sêmen diluído de carneiros sobre o estresse oxidativo e o potencial fecundante após criopreservação. Foram coletados 10 ejaculados de 3 carneiros (n=30) e diluídos em Tris-Gema de ovo até a concentração final de 200x106 sptz/mL e, mantidos em banho maria a 32°C. Os antioxidantes foram adicionados da seguinte forma: controle (sem adição de antioxidantes); 100μM de melatonina (MEL) + 0,05% de ácido ascórbico (AA); 100μM de MEL + 90μL de Trolox C (TRO); 90μL de TRO + 0,05% de AA; e 100μM de MEL + 0,05%AA + 90μL de TRO. Depois, o sêmen foi resfriado em câmara fria a 5°C por duas horas, após esse período, envasado e lacrado em palhetas de 0,5mL, e então acondicionado sob vapor de nitrogênio liquido (N2L), a 8cm da lâmina líquida por 15 minutos, e depois imersos no N2L. As amostras foram analisadas quanto à motilidade espermática, integridade da membrana plasmática e da membrana acrossomal, atividade mitocondrial, teste de ligação e a quantificação do estresse oxidativo. As variáveis foram submetidas à análise de variância e medias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A motilidade (total e progressiva) foi maior (P<0,05) quando adicionado à associação MEL+AA+TRO (67% e 49,89%), MEL+AA (64,37% e 45,61%) e MEL+TRO (61,65% e 41,15%) comparado ao tratamento controle (55,52% e 36,54%) e TRO+AA (57,07% e 38,40%). A adição de MEL+AA+TRO ao sêmen diluído manteve (P<0,05) a integridade da membrana plasmática (30,75%) e acrossomal (84,53%) dos espermatozoides quando comparado ao tratamento controle (15,60 e 68,16%, respectivamente), além de ter promovido maior (P<0,05) atividade mitocondrial (96,43%) quando comparado aos demais tratamentos. O número de espermatozoides que apresentaram à capacidade de ligação a membrana perivitelina da gema de ovo foi maior (P<0,05) no sêmen tratado com as diferentes associações de antioxidante quando comparado ao controle, sendo a associação MEL+AA+TRO (178,36%) superior (P<0,05) aos demais tratamentos. Não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos quanto a quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico produzidos. Conclui-se que a adição de MEL+AA+TRO ao sêmen diluído de carneiros, nas doses avaliadas, melhora a qualidade espermática após descongelação.

ABSTRACT: Aimed to evaluate the effect of adding antioxidants as ascorbic acid, melatonin and Trolox C to diluted semen of ram with oxidative stress to potenciate fertilization after cryopreservation. Ten samples collected were diluted in Tris-egg yolk to a final concentration of 200x106 sperm/mL and kept in a water bath at 32°C. Antioxidants were added as follows: 100μM melatonin (MEL) +.05% ascorbic acid (AA); 100μM of MEL + 90μL of Trolox C (TRO); 90μL of TRO + 0.05% AA; and 100μM of MEL0.05% AA + 90μL of TRO. Semen was cooled in a cold chamber at 5°C for two hours and packaged, sealed in 0.5mL straws, packaged under liquid nitrogen vapor (N2L), 8cm of water depth for 15 minutes, and then immersed in N2L. Samples were assayed for motility, integrity of the plasma membrane and acrosomal membrane, mitochondrial activity, binding assay and oxidative stress spermatozoa. The variables were analyzed by ANOVA and means compared by Tukey test (P<0.05). Percentage of total and progressive motility was higher for sperm treated with MEL+AA+TRO (67% and 49.89%), MEL+AA (64.37% and 45.61%) and MEL+TRO (61.65% and 41.15%) compared with the other treatments (P<0.05). The integrity of the plasma membrane and acrosome was higher for all semen treated with antioxidant associations compared with control (P<0.05). Mitochondrial activity was higher in sperm treated with MEL+AA+TRO compared all treatments (P<0.05). The number of sperm binding to perivitelline membrane was higher for semen treated with antioxidant associations compared with control; also sperm treated with MEL+AA+TRO demonstrated higher effect of all (P<0.05). No difference was observed between the treatments by oxidative stress sperm (P>0.05). The addition of melatonin, ascorbic acid and Trolox C in diluted semen of ram improves sperm quality after thawing.

Resumo A conservação do sêmen suíno em temperaturas mais baixas pode permitir uma maior expansão da inseminação artificial nessa espécie. A gema de ovo apresenta propriedades crioprotetoras já amplamente testadas na conservação seminal de diversas espécies. Este trabalho teve por objetivo testar diferentes curvas de temperatura na conservação do sêmen suíno diluído em água de coco em pó (ACP®-103) acrescido de 7% de gema de ovo e verificar qual delas mantém por mais tempo a viabilidade espermática. Para tanto, o sêmen de 36 ejaculados foi diluído e conservado a 17, 10 e 5 °C. Diariamente foram realizadas análises de vigor e motilidade e nos dias D0, D2 e D4 o sêmen foi avaliado quanto à sua viabilidade, morfologia acrossomal e resistência osmótica. Para a análise estatística foram utilizados os testes de Kruska-Wallis, com pós-teste de Dunns (dados não paramétricos) e Anova com teste de Tukey (dados paramétricos). A conservação à temperatura de 10 °C foi a que melhor manteve o vigor espermático e a motilidade em níveis adequados para ser utilizado em um programa de inseminação artificial. As análises de vitalidade, morfologia e teste hiposmótico não apresentaram diferença estatística entre os tratamentos avaliados. Em conclusão, a melhor curva de temperatura foi a de 10 °C com sêmen diluído por manter por um período maior a viabilidade da célula espermática suína.

Abstract The conservation of boar semen at lower temperatures might contribute to the further expansion of artificial insemination in this species. Egg yolk cryoprotectant properties have already been extensively tested on sperm cryopreservation of several species. This study aimed to test different temperature curves for the conservation of boar semen diluted with coconut milk powdered (ACP®-103) add 7% egg yolk and to verify which one better maintains sperm viability. For this, 36 ejaculates were diluted and stored at 17, 10 and 5 °C. Daily analysis of vigor and motility were performed, and on days D0, D2, and D4 semen was evaluated regarding vitality, morphology, and osmotic resistance. For the statistical analysis we performed the tests of Kruska-Wallis with Dunns post-test (nonparametric data) and ANOVA and Tukey test (parametric data). The storage temperature of 10 °C was the best one to maintain spermatic motility at appropriate levels to be used in an artificial insemination program. Analyses of viability, morphology, and hypoosmotic test did not show statistical difference among the treatments. In conclusion, the best temperature curve was 10 °C with diluted semen previously kept at 17 °C to maintain the viability of sperm cells in pigs for a longer period.

Resumo: Objetivou-se avaliar o efeito da adição de diferentes concentrações de melatonina no sêmen diluído de carneiros após criopreservação. Foram coletados 10 ejaculados de três carneiros adultos (n=30), por meio de vagina artificial para ovinos. Os ejaculados coletados foram diluídos em Tris-Gema de ovo, para a concentração final de 200x106 sptz/mL, mantidos em banho maria a 32°C, e a melatonina adicionada conforme os tratamentos: Controle; 100pM; 100nM; 100μM e 1mM de melatonina. Então, as amostras foram resfriadas em câmara fria a 5°C por duas horas, envasadas em palhetas de 0,5 mL e lacradas. Logo após, foram acondicionadas sob vapores do nitrogênio liquido, por 15 minutos, a 8cm da lâmina líquida e congeladas com nitrogênio líquido. As amostras foram analisadas quanto à motilidade espermática, integridade da membrana plasmática, membrana acrossomal, atividade mitocondrial, quantificação do estresse oxidativo e a capacidade de ligação. As variáveis foram submetidas à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A motilidade total e progressiva dos espermatozoides descongelados foi maior nas amostras tratadas com 100pM de melatonina (62,99 e 45,07% respectivamente; P<0,05) quando comparado aos demais tratamentos. A adição das diferentes concentrações de melatonina no sêmen diluído, com exceção da concentração de 1 mM, apresentou maior percentual de células com membrana plasmática íntegra, quando comparadas com o controle (P<0,05). O percentual de espermatozoides com integridade da membrana do acrossoma foi maior no sêmen tratado com 100 pM de melatonina (P<0,05) do que nos demais tratamentos. A alta atividade mitocondrial foi maior nos espermatozoides tratados com 100 pM de melatonina (69,30%; P<0,05). A adição de 100 nM de melatonina reduziu a quantidade de TBARS após a criopreservação (2,84; P<0,05) quando comparado aos demais tratamentos. Após o descongelamento, o número de espermatozoides que se ligaram à membrana perivitelina foi maior nos tratados com 100 pM de melatonina (155,73; P<0,05). Portanto, a adição de melatonina no sêmen diluído pode ser útil para aperfeiçoar a criopreservação do sêmen de ovinos, melhorando as taxas de fertilização por meio da inseminação artificial.

Abstract: The aim was to evaluate the effect of adding different concentrations of melatonin in ram semen diluted after cryopreservation. Ten ejaculates were collected0 from three adult ram (n=30) by means of artificial vagina for sheep. The collected samples were diluted in Tris-egg yolk, to a final concentration 200x106 sptz/mL kept in water bath at 32°C, and melatonin added as treatments: control; 100pM; 100nM; 100μM and 1mM melatonin. Then, the samples were cooled in a cold chamber at 5°C for two hours, in straws of 0.5mL and sealed. They were stored under the liquid nitrogen vapor for 15 minutes to 8cm of liquid blade and frozen with liquid nitrogen. Samples were analyzed for sperm motility, membrane integrity, acrosomal membrane, mitochondrial activity, oxidative stress and quantification of the binding capacity. The variables were subjected to analysis of variance and the means were compared by Tukey test at 5% probability. The total and progressive motility of thawed sperm were higher in samples treated with 100pM melatonin (62.99 and 45.07%, respectively; P<0.05) when compared to other treatments. The addition of different concentrations of melatonin in semen diluted with the exception of 1mM concentration, a higher percentage of cells with intact plasma membrane, as compared with the control (P<0.05). The percentage of sperm with acrosome membrane integrity was higher in the semen with 100pM melatonin (P<0.05) than the other treatments. The high mitochondrial activity was higher in spermatozoa treated with 100pM melatonin (69.30%; P<0.05). Addition of 100nM melatonin reduced the amount of TBARS after cryopreservation (2.84, P<0.05) when compared with the other treatments. After thawing, the number of sperm which bind to the perivitelline membrane was higher in the melatonin treated with 100pM (155,73; P<0.05). Therefore, melatonin addition the semen diluted can be useful to enhance the cryopreservation of sheep semen, improving fertilization rates through artificial insemination.

Resumo Muitas tentativas são feitas para se melhorar a conservação do sêmen suíno, sendo a gema de ovo conhecida por suas propriedades crioprotetoras. Este trabalho teve por objetivo testar diferentes concentrações de gema de ovo em pó (GOP), adicionada ao diluente água de coco em pó (ACP-103®), e verificar qual mantém melhor a viabilidade espermática. Foram diluídos 36 ejaculados em ACP-103®, acrescidos de diferentes concentrações de GOP (0%, 1%, 3%, 5% e 7%) e conservados a 17 °C. Diariamente, foram realizadas análises de vigor e motilidade e nos dias 1 (D0), 3 (D2) e 5 (D4) de conservação foram feitas as de vitalidade, morfologia e resistência osmótica. Utilizou-se o teste estatístico de Kruskal-Wallis e de Dunn's para dados não paramétricos e ANOVA e Tukey para os paramétricos. Queda de vigor e motilidade foi observada em todos os tratamentos. Os GOP-3%, GOP-5% e GOP-7% foram os que melhor mantiveram o vigor espermático em D0 (2,4±0,8; 2,5±1,1 e 2,8±0,9, respectivamente), sem diferenças significativas entre si. O mesmo ocorreu para a motilidade (77±15%, 74±23% e 81±16% em D0). Os resultados das análises de vitalidade, morfologia e resistência osmótica não diferiram. Em conclusão, as concentrações entre 5 e 7% de GOP adicionado ao ACP-103® permitem sua utilização como diluente eficiente para manter a qualidade espermática.

Abstract Many attempts have been made to improve the conservation of boar semen. Egg yolk is known to have cryoprotectant properties. This study aimed to test different concentrations of egg yolk added to the coconut milk powder extender (ACP-103®), and verify which one is better to maintain sperm viability. The ejaculated (36) were diluted in ACP-103® supplemented with different concentrations of egg yolk (0%, 1%, 3%, 5% and 7%). The conservation occurred at 17 °C, and vigor and motility analysis were carried out daily. On days 1 (D0), 3 (D2) and 5 (D4) the semen was evaluated for vitality, morphology and osmotic resistance. For statistical nonparametric analysis Kruskal-Wallis and Dunn's tests were performed, and for parametric data ANOVA and Tukey test were used. A decrease in vigor and motility was observed in all treatments. Treatments T2, T3 and T4 better maintained spermatic on D0 (2.4±0.8, 2.5±1.1, and 2.8±0.9, respectively), with no significant differences among them. The same was observed for motility (77±15%, 74±23%, and 81±16% on D0). Analyses of vitality, morphology and osmotic resistance did not show statistical difference among treatments. In conclusion, the concentration of egg yolk (7%) added to the ACP-103® can be effectively used as extender to maintain sperm viability.

Resumo O uso de diluentes adequados é importante para o sucesso de um programa de inseminação artificial. O objetivo deste experimento foi avaliar a eficiência de diluentes alternativos para o sêmen suíno, em diferentes temperaturas (17 e 10 °C). Foram utilizados os diluentes: Beltsville Thawing Solution (BTS); água de coco em pó (ACP®-103) e leite em pó desnatado (LPD). Os 50 ejaculados, foram analisados in natura e após diluição, diariamente, durante os 5 dias de conservação do sêmen (D0 a D4), quanto ao vigor e motilidade espermática. Avaliou-se a integridade do acrossoma e a viabilidade espermática no D0 e D4. Na análise estatística, foram utilizados os testes de Mann-Whitney, Students, Tukey e o qui-quadrado, com intervalo de confiança de 5%. O diluente LPD a 10 °C apresentou motilidade e vigor espermático melhores em relação ao BTS e ACP (10 °C) até D2 e aos tratamentos conservados a 17 °C. A vitalidade e integridade acrossomal, no D0 e D4, foram melhores com LPD a 10 °C, que mostrou ser um bom meio diluente para o sêmen suíno em temperatura mais baixa (10 °C), conferindo uma maior proteção à célula espermática, através de maiores taxas de viabilidade e integridade de acrossoma.

Abstract The use of appropriate extenders is important for the success of an artificial insemination program. The objective of this study was to evaluate the efficiency of alternative extenders for swine semen at different temperatures (17 to 10 °C). The following extenders were used: Beltsville Thawing Solution (BTS), powdered coconut water (ACP-103®), and skimmed milk powder (LPD). The 50 ejaculates were analyzed daily, in natura and after dilution, during the 5-day period of semen preservation (D0 to D4), regarding spermatic vigor and motility. Acrosome integrity and sperm viability were evaluated on D0 and D4. Data were analyzed using Mann-Whitney, Students, Tukey and chi-square tests (p<0.05). The LPD extender at 10 °C presented higher motility and sperm vigor compared to BTS and ACP until D2, and to treatments stored at 17 °C. Acrosome vitality and integrity remained higher (p<0.001) with LPD at 10 °C on D0 and D4. LPD showed to be a good extender for the swine semen at lower temperature (10 °C). Furthermore, it provided better protection to sperm cells, by allowing greater integrity and vitality of the acrosome.

O aperfeiçoamento das técnicas que objetivam a exploração do potencial reprodutivo das fêmeas requer a compreensão mais ampla dos mecanismos de controle de desenvolvimento folicular. Uma alternativa de estudo nesta esfera, é a quantificação da expressão relativa de genes envolvidos nos processos de recrutamento, seleção e desenvolvimento folicular, pelo emprego da técnica de transcrição - reversa associado a reação em cadeia pela polimerase (RT - PCR). O presente trabalho objetivou quantificar a expressão relativa dos genes insulin-like growth factor I (IGF-I) e do receptor do hormônio folículo estimulante (FSHR), tendo como controle interno o gene da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Foram utilizados ovários bovinos de animais de matadouro em diferentes fases do ciclo estral. O RNA total dos folículos e tecido ovarianos foi purificado por TRIZOL. As reações de RT-PCR foram realizadas com o "kit" SuperScriptTM First-Strand. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose e as bandas submetidas à análise densitométrica. Todos os genes foram amplificados observando-se a curva exponencial de amplificação, a validação do método foi realizada através de análise de regressão, sendo estabelecido o coeficiente de amplificação (E). A expressão relativa de mRNA para cada gene de interesse foi calculada pela fórmula estabelecida por Prelle et al.12. Em todos os tecidos analisados, todos os genes foram expressos, sobressaltando-se diferenças nos diferentes ciclos estudados. Com relação os dados referentes ao coeficiente de amplificação (E), observou-se tanto para gene controle (GAPDH), como para o gene IGF-I concordância nos valores encontrados para as diferentes classes analisadas. Quanto ao gene IGF-I, a interpretação dos achados para a expressão relativa de mRNA pode está relacionada ao caráter constitutivo dessa proteína ou devido os transcritos não serem dependentes dos níveis de FSH. Observou-se diferenças na expressão relativa de mRNA de FSHR entre as classes de tecidos analisados, o que pode ser explicado pela variação do número de receptores nas células da granulosa nas diferentes fases do ciclo estral. Pode-se perceber a partir desse estudo que a técnica de RT-PCR semi quantitativo é de grande importância biotecnológica, possibilitando auxílio na compreensão da dinâmica folicular. Entretanto esses estudos devem ser ampliados com outros genes para melhor compreensão das etapas fisiológicas envolvidas na foliculogênese.

The improvement of techniques to maximize reproductive potential of females needs the whole comprehension of the controlling mechanisms of follicular development. An alternative for this purpose is the quantification of relative gene expression from those genes involved in recruitment, selection and follicular development, using reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT - PCR). The present study aimed to quantify relative gene expression from insulin-like growth factor I (IGF-I) and follicle stimulating hormone receptor (FSHR) in cattle (Bos primigenius indicus), using as internal control the gliceraldheyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene. Ovaries in different estral cycle stages were obtained from slaughtered animals. Total RNA from follicles and ovarian tissue was purified and the RT-PCR conditions were standardized. PCR products were analyzed in ethydium bromide agarose gels and the bands submitted to densitometric analysis. Exponential amplification curves were constructed and the method's validation was performed using regression analysis to determine the amplification coefficient (E) for each of the three genes. Relative expression for each gene was calculated using the formula described by Prelle et al.12. In every sample there was gene expression detected for each gene showing differences related to cycle temperature. Amplification coefficient (E) was similar between control gene (GAPDH) and IGFI, independently of the class analyzed. IGFI linear amplification could be related to the constitutive characteristic of this protein since the transcripts are not dependents of FSH levels. It was observed difference in FSHR mRNA expression between the classes analyzed. It could be due to the variation of the receptor number in granulosa cells for each different phase of estral cycle. Semi-quantitative RT-PCR has a large application in biotechnology since it is useful to help us the better understanding of follicular dynamics. However these studies must be conducted using other genes in order to provide new clues for the physiology of folliculogenesis.